การวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการ

        ไวรัสที่ทำให้เกิดโรคระบบทางเดินหายใจมีได้มากมายหลายชนิด  และแต่ละชนิดก็ทำให้เกิดลักษณะอาการทางคลินิกได้หลายแบบ  และในทำนองเดียวกันโรคหรือลักษณะอาการเดียวก็อาจมีสาเหตุจากการติดเชื้อไวรัสได้หลายชนิด  ดังนั้นการบอกถึงตัวเชื้อต้นเหตุจึงทำได้โดยอาศัยการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการเท่านั้น

                1.การตรวจจากตัวอย่างตรวจโดยตรง  ตัวอย่างตรวจ  เช่น  สิ่งดูดจากนาโสฟาริงซ์ (nasopharyngeal aspirate) สิ่งดูดจากหลอดลม (tracheobronchial aspirate) และ  bronchoalveolar lavage  ซึ่งเก็บใน  transport media หรือชิ้นเนื้อเมื่อผู้ป่วยถึงแก่กรรม  ในตัวอย่างตรวจดังกล่าวจะมีเซลล์ติดเชื้อหลุดร่วงปนออกมา  ถ้ามีมูกจะต้องปั่นล้างเซลล์หลายครั้งห้หมดมูกเสียก่อนนำเซลล์ไปป้ายบนกระจกสไลด์หลายๆ ตำแหน่ง  แล้วนำไปทดสอบโดยวิธี  immunofluorescence กับแอนติซีรั่มจำเพาะต่อเชื้อไวรัสหลายๆ ชนิด  เพื่อตรวจหาแอนติเจนของไวรัส  วิธีนี้จัดเป็นวีการวินิจฉัยโดยรวดเร็ว (rapid diagnosis) สำหรับโรคติดเชื้อระบบทางเดินหายใจ

                วิธีนี้มีข้อจำกัดอยู่ที่ว่าจะวินิจฉัยได้เฉพาะไวรัสบางชนิดที่สามารถเตรียมแอนติซีรั่มจำเพาะขึ้นมาใช้ได้เท่านั้น  จึงมักใช้ตรวจวินิจฉัยไวรัสสาเหตุก่อโรคที่พบได้บ่อย  เช่น  influenza viruses, RSV, parainfluenza types 1-3 และ  adenovirus

                นอกจากนี้มีการตรวจหาแอนติเจนของไวรัสในสภาพสารละลายโดยวิธี ELISA ด้วย

               2.การแยกเชื้อและการพิสูจน์เชื้อ  ตัวอย่างตรวจ  เช่น  ส่วนน้ำใสที่ได้จากการปั่นสิ่งดูดจากนาโสฟาริงซ์  เสมหะที่เก็บใน  transport  media, nasal  wash, nasal swab, thoat  swab หรือน้ำกลั้วคอ  แต่ได้พบว่า thoat  swab มีโอกาสแยกเชื้อได้ต่ำตัวอย่างตรวจจากนาโสฟาริงซ์  ควรเก็บตัวอย่างตรวจภายใน  3  วันภายหลังอาการ

                การแยกเชื้อไวรัส  จะต้องใช้เซลล์เพาะเลี้ยงหลายประเภทเพื่อที่จะครอบคลุมชนิดของไวรัสได้กว้างขวาง 

                Respiratory syncytial virus เจริญเพิ่มจำนวนได้ดีในเซลล์คน เช่น HeLe, HEp-2 และ MRC-5 ที่อุณหภูมิ  35 องศา  เซลล์ติดเชื้อเปลี่ยนแปลงรูปร่างเกิด CPE ซึ่งมีลักษณะเป็นเซลล์หลายเซลล์มาเชื่อมหลอมรวมกันเป็นเซลล์ที่มีหลายนิวเคลียส  เรียกว่า  syncytial cell  บางเซลล์มีนิวเคลียสถึง 50-100 เม็ด  นิยมพิสูจน์เชื้อที่แยกได้  โดยนำเซลล์ที่ติดเชื้อไปย้อมด้วยวิธี immunofluorescence

                Adenoviruses  เจริญได้ดีในเซลล์คน เช่น HeLe, HEp-2 และ MRC-5 เช่นกัน  ใช้อุณหภูมิ 35-36 องศา เซลล์ติดเชื้อให้ CPE ลักษณะกลม วาวแสง อยู่กันเป็นกลุ่ม  และไซโตพลาสซึมของเซลล์ในแต่ละกลุ่มจะยื่นเป็นสายไปแตะกันทำให้มองเห็นลักษณะคล้ายผ้าลูกไม้โปร่ง การพิสูจน์เชื้อที่แยกได้ทำโดยย้อมเซลล์มี CPE ด้วยวิธี immunofluorescence ซึ่งจะบอกได้เพียงว่าเชื้อนั้นเป็น Adenoviruses หรือไม่ แต่ถ้าต้องการทราบถึง type จะต้องทดสอบด้วยวิธี NT

                Rhinoviruses เชื้อนี้เจริญได้ดีใน human  fibroblast เท่านั้น เช่น เซลล์ WI-38 หรือ MRC-5 การแยกเชื้อทำที่อุณหภูมิ  33 องศาเซลเซียส และจะใส่หลอดเซลล์เพาะเลี้ยงที่หยอดตัวอย่างตรวจแล้วใน  roller drum ทำให้หลอดเซลล์หมุนไปได้รอบ  มีการถ่ายเทอากาศในน้ำเลี้ยงเซลล์ได้ดีขึ้น  เชื้อ Rhinoviruses ทำให้เกิด CFE เซลล์รูปร่างกลมเกิดเป็นเซลล์เดี่ยวกระจายทั่วทั้งหลอด  ลักษณะ CFE ของ Rhinoviruses จะคล้ายกับ enteroviruses  แต่แยกจากกันได้โดยการทดสอบความเป็นกรด  เชื้อ Rhinoviruses ไม่ทนกรด แต่ enteroviruses จะทนกรดได้ดี  การพิสูจน์ typeของ Rhinoviruses ทำได้โดย neutralization test  แต่ไม่เป็นที่นิยม  เพราะมีจำนวน type มากมาย  คงนิยมทำสำหรับ enteroviruses เท่านั้น

               3.  การตรวจหาแอนติบอดี  นิยมตรวจหาแอนติบอดีไตเตอร์ในซีรั่มคู่โดยวิธี CF หรือถ้าเป็นไวรัสที่มีสารฮีแมกกลูตินินก้อาจทดสอบโดยวิธี HI ได้  ถ้า convalescent  serum  มีแอนติบอดีไตเตอร์สูงกว่าซีรัมแรกอย่างน้อยสี่เท่า  แสดงว่าผู้ป่วยติดเชื้อไวรัสที่นำมาใช้เป็นแอนติเจนในการทดสอบนั้น

                ข้อจำกัดของการตรวจหาแอนติบอดีก็คือ  ต้องมีแอนติเจนเฉพาะสำหรับแต่ละไวรัสเพื่อการทดสอบ

                สำหรับการตรวจหา IgM จำเพาะเพื่อวินิจฉัยไวรัสก่อโรคระบบทางเดินหายใจนั้น การวินิฉันในการทดสอบผู้ป่วยของโรงพยาบาลศิริราชชี้ให้เห็นว่า อาจไม่เป็นประโยชน์เท่าที่ควรถ้านำมาใช้ในเด็กเล็ก  ทั้งนี้เนื่องจากมีไวรัสก่อโรคหลายชนิด และเชื้อแต่ละชนิดให้ลักษณะอาการทางคลินิกที่คล้ายคลึงกัน  เด็กเล็กติดเชื้อไวรัสเหล่านี้ได้บ่อย การเกิดโรคระบบทางเดินหายใจในเด็กเล็กเกิดขึ้นได้หลายครั้งในหนึ่งปี  ในขณะที่ IgM  จำเพาะต่อการติดเชื้อครั้งเดิมยังไม่หมดไปเด็กก็ติดเชื้อก่อโรคระบบทางเดินหายใจชนิดใหม่อีกแล้วการแปลผลการวินิจฉัยโรคด้วยการตรวจหา IgMจำเพาะในซีรัมจึงอาจผิดพลาดได้

                นอกจากนี้ในเด็กป่วยบางรายในห้องปฏิบัติการตรวจพบแอนติเจนของไวรัสในเซลล์จากนาโสฟาริงซ์และแยกเชื้อไวรัสจากผู้ป่วยด้วย อาจไม่สามารถสร้างแอนติบอดีจำเพาะตอบสนองต่อการติดเชื้อไวรัสนั้น  ทั้งนี้เนื่องจากระบบอิมมูนของเด็กยังไม่สมบูรณ์พอ   ในผู้ป่วยเด็กอายุต่ำกว่า 5 ปีที่รับไวรัสในโรงพยาบาลศิริราชเนื่องจากติดเชื้อระบบทางเดินหายใจส่วนล่างจากเชื้อ RSV มีน้อยรายมากที่สามารถสร้างอิมมูโนโกลบุลินจำเพาะชนิด  IgG, IgA และ  IgM    ได้ทั้ง 3 classes

 _